Izvori ukazuju na to da je Leonardo imao asistente i učenike u Milanu, za koje je vjerojatno napisao različite tekstove kasnije izdane pod naslov
om Rasprava
(monografija) o slikanju (1651.; prevedeno 1956.). Najvažnija od njegovih slika
iz ranog Milanskog perioda je Bogorodica u pećini i to u dvije verzije (1483. –
1485., Louvre, Pariz; 1490-te do 1506. – 1508., Nacionalna galerija, London).
Radio je na kompoziciji dugo vremena, naoko mu se nije dalo dovršiti započeto,
što mu je bio običaj (do kraja života dovršio je tek nekoliko djela). Leonardo
je među prvima uveo atmosfersku perspektivu (efekt atmosfere koji bojom i
definicijom dočarava udaljeni krajolik); pozadinski krajolik oslikan na ovaj
način posebno je uočljiva karakteristika Leonardovih slika. Najveći majstori
kasne renesanse u Firenci – Rafael, Andrea del Sarto i Fra Bartolomeo, učili su
od Leonarda; potpuno je preobličio milansku školu, a Parmu, umjetnički centar
Correggia, usmjerio je Leonardov rad.Od 1495. do 1497. godine Leonardo je radio na svom remekdjelu, Posljednjoj večeri, zidnoj fresci u blagovaonici samostana Santa Maria delle Grazie u Milanu. Nažalost, njegovo eksperimentalno korištenje ulja na suhoj žbuci (tanak vanjski zid prostora konstruiranog za serviranje hrane) dovelo je do tehničkih problema, pa je do godine 1500. zidna freska počela propadati. Do 1726. pokušavalo se, bezuspješno, restaurirati fresku; zajednički konzervacijski i restauracijski program, temeljen na najmodernijoj tehnologiji, započet 1977. godine uspio je sanirati dio oštećenja. Iako je mnogo izvorne plohe propalo, veličanstvenost kompozicije i prodorna karakterizacija figura daju prolaznu viziju svoje iščezle raskoši.
Leonardove stilističke inovacije u slikarstvu još su uočljivije u Posljednjoj večeri u kojoj je rekreirao tradicionalnu temu na potpuno nov način. Umjesto prikaza dvanaestorice apostola kao individualnih figura, grupirao ih je po troje u dinamičnu kompoziciju oko lika Isusa Krista, koji je izoliran u sredini slike. Posjednut ispred blijedog, udaljenog krajolika gledanog kroz pravokutni otvor na zidu, Hrist – koji naslućuje da će ga jedan od prisutnih izdati – predstavlja mirno i spokojno središte, dok ostali likovi reagiraju živahnim gestama. U veličanstvenosti scene i ozbiljnosti figura, Leonardo nam ponovno predstavlja stil kojeg je utvrdio više od jedne generacije prije Masaccio. Leonardova originalnost i inventivnost bila je, a i danas je primjer fantastične kreativnosti i upornosti.
Za vrijeme svog dugotrajnog boravka u Milanu, Leonardo je također izveo druge slike i crteže (od kojih je većina danas izgubljena), nacrte kazališta, arhitektonske crteže, modele za kupolu Milanske katedrale, te čak dizajnirao stroj za letenje. Njegova najveća narudžba bila je za kolosalnu brončanu konjaničku statuu Francesca Sforze, Ludovikova oca, za dvorište Castella Sforzesca.
Zbog činjenice da ni jedan Leonardov skulpturalni projekt nije dovršen, njegov pristup trodimenzionalnoj umjetnosti može se prosuditi samo po njegovim crtežima (nacrtima). Slična se zamjerka može uputiti njegovim arhitektonskim projektima; ni jedan od njegovih građevinskih projekata nije zapravo ostvario njegove naume. U svojim arhitektonskim nacrtima, ipak, demonstrirao je veličanstvenost u upotrebi masivnih formi, čistoću izraza i posebice duboko shvaćanje starovjekovnih Rimskih izvora i antike općenito.
U decembru 1499. godine, ipak, obitelj Sforzu odvele su iz Milana francuske snage. Leonardo je napravio glineni model, ali igrom slučaja odlučeno je da se metal namijenjen za statuu utroši za proizvodnju topova. Model su uništili francuski strijelci, koji su ga koristili kao metu. Leonardo 1499. napušta Milano da bi se vratio u Firencu, ali ostaje neko vrijeme u Mantovi i Veneciji.