Za vrijeme drugog firentinskog perioda, Leonardo je naslikao nekoliko portreta, ali samo jedan je sačuvan do dana današnjeg – famozna Mona Lisa (1503. – 1506., Louvre, Pariz), jedan od najslavnijih portreta ikada naslikanih. Portret je također poznat kao "La Gioconda". Leonardo je, čini se, imao posebnu sklonost za taj portret, jer ga je nosio na sva svoja kasnija putovanja. Ovaj Leonardov najslavniji rad je poznat kako po veličanstvenosti tehničkih inovacija, tako i po misterioznosti legendarnog osmijeha. Postoje mišljenja da je ovaj Leonardov portret zapravo jedan od autoportreta slavnog slikara, te da je prvobitna Mona Lisa imala obrve, ali da su one zbog Leonardovog eksperimentisanja vremenom iščezle.Taj rad je savršen primjer dvije tehnike – sfumata i krajoskura (rasporeda svjetla i sjene, svijetlih i tamnih dijelova na slici) – koje je Leonardo primijenio među prvima. Sfumato (začađeno) je delikatan atmosferični "magloviti" ili "dimni" efekt načinjen finim, vrlo malenim prijelazima između područja boje; to je posebice uočljivo na nježnoj prozračnoj odjeći i zagonetnom osmjehu. Kjaroskuro (Chiaroscuro, svjetlo i sjena) je tehnika modelisanja i definisanja forme pomoću odnosa kontrasta između svjetlosti i sjene; senzitivne ruke modela su portretisane jasnom modulacijom svjetlosti i sjene, dok je kontrast boja oskudno upotrebljavan.
Leonardo da Vinci je pored eksperimentisanja sa bojama imao i sklonos ka nedovršivanju svojih djela, pa je tako veliki dio njegovog rada ostao nedovršen. Leonardo nije završio svoju prva značajna slika, Poklonstvo kraljeva (Uffizi), započeta 1481.god., naručenu za samostan San Donato a Scopeto u Firenci; modele za kupolu milanske katerdale; dekoraciju za veličanstvenu dvoranu Pallazza Vecchia. Tema je bila Bitka kod Anghiaria, Firentinska pobjeda u ratu protiv Pise itd.
Njegova najveća narudžba bila je za kolosalnu bronzanu konjaničku statuu Francesca Sforze, za dvorište Castella Sforzesca Leonardo je napravio glineni model, ali igrom slučaja odlučeno je da se metal namijenjen za statuu utroši za proizvodnju topova. Model su uništili francuski strijelci, koji su ga koristili kao metu.